張發(fā)仁，許麗艷，沈忠英，李恩民
(1汕頭大學醫(yī)學院腫瘤病理學教研室；
2汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，廣東汕頭515041)
汕頭大學醫(yī)學院學報2005年第4期
[摘要]
自噬是廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象，是生物在其發(fā)育、老化過程中都存在的一個凈化自身多余或受損細胞器的共同機制。生命體籍此維持蛋白代謝平衡及細胞環(huán)境穩(wěn)定，這一過程在細胞清除廢物、結構重建、生長發(fā)育中起重要作用。本文主要對自噬體的形態(tài)和發(fā)生過程、分子機制、生化檢測、與細胞凋亡的關系及其生理、病理功能等方面進行概述，以期較為全面地了解細胞自噬作用和新研究動態(tài)的相關資料。
自噬是細胞通過單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬體，然后運送到溶酶體形成自噬溶酶體并進行多種酶的消化及降解，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。而細胞對這種合成與降解的精細調節(jié)，對維持細胞的自身穩(wěn)態(tài)有重要意義。降解細胞內物質的途徑主要有：
①蛋白酶體，主要消化短壽命蛋白質；
②通過形成自噬體，將待降解物(如大多數(shù)長壽命蛋白質和細胞器)運輸?shù)饺苊阁w內消化。
自噬是溶酶體降解途徑的主要步驟，通過對自噬體的檢測，可了解自噬體形態(tài)和發(fā)生過程、分子機制、與細胞凋亡的關系及其在某些疾病發(fā)生中的作用。
1自噬與自噬體的形態(tài)及發(fā)生過程
自噬是胞漿大分子物質和細胞器在膜包囊泡中大量降解的生物學過程。在此過程中，自噬體的形成是關鍵。在透射電子顯微鏡下自噬體的直徑一般為300～900nm，平均500nm，其雙層膜包囊泡內常見的包含物有胞漿成分和某些細胞器如線粒體、內吞體、過氧化物酶體等。根據(jù)細胞物質運到溶酶體內的途徑不同，自噬分為：
①大自噬：多數(shù)人認為是由內質網來源的單層膜凹陷形成杯狀雙層膜樣的分隔膜，進而完全包繞待降解物形成自噬體，接著與溶酶體融合，自噬體內細胞物質如細胞器被溶酶體酶溶解。
②小自噬：是溶酶體的膜直接包裹如長壽命蛋白并在溶酶體內降解。
③分子伴侶介導的自噬(CMA)：胞漿內蛋白結合到分子伴侶后被轉運到溶酶體腔中被溶酶體酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白分子，所以CMA降解途徑在清除蛋白質時有選擇性，而前兩者無明顯的選擇性。
自噬的發(fā)生過程以大自噬為例可人為的將它分為4個階段(圖1)：
①分隔膜的形成。在饑餓、某些激素等因素刺激下，有雙層膜的杯狀分隔膜開始在被降解物的周圍形成。
②自噬體的形成。隨著分隔膜逐漸延伸，將要被降解的胞漿成分完全包繞隔離開形成自噬體。
③自噬體的運輸、融合。自噬體形成后將其包裹物運輸至溶酶體內與溶酶體融合形成自噬溶酶體，這一過程并非簡單的擴散，而是通過細胞骨架微管網絡系統(tǒng)的傳輸實現(xiàn)的。
④自噬體的裂解。自噬體融合后被溶酶體中的水解酶溶解，它先經過囊泡酸化，達到所需pH值后經多種蛋白酶作用使囊內容物降解，降解產物在細胞內再循環(huán)利用。
2真核細胞中自噬的分子調控
2．1自噬體形成的分子機制
根據(jù)酵母自噬體的發(fā)生過程可分為：
①自噬的誘導：雷帕霉素作用的靶位點(Target ofrapamycin，TOR)是氨基酸、ATP和激素的感受器，它在調節(jié)細胞生長和自噬的發(fā)生過程有重要作用。與bcl-2作用的蛋白beclin-1可以促進缺乏自噬作用的酵母細胞中的自噬作用。此外，GDP結合的C蛋白亞基Gai3是自噬的活化因子，高濃度cAMP也會誘導自噬的發(fā)生。
②自噬體的形成：在酵母中發(fā)現(xiàn)自噬體的形成依賴于兩個泛素樣結合系統(tǒng)——Apg12-Apg5和Apg8系統(tǒng)。這種蛋白系統(tǒng)的高度保守性已被實驗證明，在人類發(fā)現(xiàn)的自噬基因有Beclin1、hApg5、hApg12。
③自噬體的運輸、融合：Rho家族涉及細胞骨架，與自噬體的運輸有關。自噬體的融合機制與SNARE蛋白Vam3、Vam7、Vti1、Sec19等密切相關。
④自噬體的裂解：在此起重要作用的有Atg15和Atg22。Atg15通過多囊泡小體途徑向小囊泡轉運，這種蛋白起著脂肪酶相似的作用。Atg22是一種囊泡內膜蛋白，和Atg15相比，其只對自噬體降解起作用。
2．2自噬的信號調控
mTOR途徑：酵母中Ser/Thr蛋白激酶Apg1與其它Apg分子結合共定位于自噬前體膜上。饑餓刺激下，Apg13去磷酸化，并與Apg1結合，導致Apg17依賴性自噬的發(fā)生。TOR激酶抑制劑雷帕霉素有助于Apg13去磷酸化和Apg1活化，促進自噬發(fā)生。磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3K)：ClassⅠPI3K磷酸化產物通過PKB/Akt調控自噬。也有某些激素在自噬調控中起重要作用，如胰島素可抑制自噬，而胰高血糖素促進之。此外，酪氨酸激酶受體、PKA、酪蛋白激酶Ⅱ、MAP激酶、鈣也存在于自噬錯綜復雜的調節(jié)網絡中，但機制不甚清楚。
3自噬體的檢測
自噬體的檢測對研究自噬尤為重要：
①以透射電子顯微鏡下超微結構的形態(tài)學檢測(俗稱檢測自噬體的金指標)。在透射電鏡下可見損傷的細胞器如線粒體的腫脹變性，其周圍出現(xiàn)空泡狀雙層膜樣結構、繼而雙層膜環(huán)繞成自噬體、進而與溶酶體融合，消化，也可見自噬溶酶體內不能降解的殘體等。
②自噬體膜標志性蛋白質的檢測。自噬體膜上標志性蛋白質有Apg12-Apg5結合體和微管相關蛋白1的輕鏈3(LC3)。Apg12和Apg5在翻譯后就像單個分子一樣共價結合在一起，它定位在自噬體雙層隔離膜的整個延長階段。LC3是酵母菌自噬基因(Apg7/Apg8)在哺乳動物中的同源物，和前者相比，LC3除了定位在自噬體分隔膜上，也一直以和磷脂酰乙醇胺即腦磷脂(PE)結合的形式(LC3-PE)存在于自噬體形成各階段的內外膜上，在自噬溶酶體膜上也可見。通過與綠色熒光蛋白(GYP)結合成Apg12-Apg5-GFP、IE3-GFP，即可實現(xiàn)對自噬體的檢測。
③單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。是自噬發(fā)生過程中分析分子水平機制的一種特異的檢測自噬體方法。自噬體形成依賴的第二個泛素樣結合系統(tǒng)(Apg8)是位于自噬囊泡膜上與MDC特異結合的生化標志，通過熒光染色，在熒光顯微鏡下可見核周區(qū)域陽性顯色。
④間接自噬體檢測法。自噬溶酶體及其不能降解的產物——殘體的檢測。自噬體和溶酶體融合后，除上述的LC3-GFP法檢測外，還有吖啶橙染色法。它是一種熒光染料作為非極性反膠態(tài)分子團的分子探針，在自噬溶酶體內酸性磷酸酶活性增強下顯著著色。對殘體的檢測主要是對脂褐素顆粒的顯微觀察。
4自噬與凋亡、壞死
細胞的死亡方式包括程序性細胞死亡和細胞壞死。其中程序性細胞死亡可分為細胞凋亡和自噬型細胞死亡。細胞凋亡的典型細胞核改變：染色質凝集邊聚、出現(xiàn)透明區(qū)，后來形成半月形核、花瓣狀核、空泡狀核等。此外，胞漿中還可見許多自噬體、自噬溶酶體和凋亡小體。細胞凋亡依賴于細胞色素C和胱門蛋白酶的作用。自噬型細胞死亡始于細胞的自噬作用，以胞漿中形成大量自噬囊泡為特征，其內存在多種細胞成分(生物大分子和細胞器等)，高爾基體、多聚核糖體、內質網的降解都早于核解體。在此過程中，線粒體功能完整，為自噬提供所需能量，當線粒體絕大部分變性、溶解，染色質斷裂、核解體時稱之為自噬型細胞死亡。細胞壞死，是由外部的化學、物理或生物因素的侵襲而造成的細胞崩潰裂解，是非溶酶體囊泡進行降解作用的細胞死亡，蘇木素-伊紅染色后光鏡下呈片狀無組織結構紅染區(qū)。
目前，人們更為關注的是對細胞凋亡的研究過程中存在著的細胞自噬以及自噬型細胞死亡。它們之間也存在一些聯(lián)系，在乳腺癌細胞誘導凋亡中可見到具有凋亡和核固縮形態(tài)改變的細胞死亡，都呈現(xiàn)廣泛的自噬體形成。從分子水平研究自噬與凋亡關系的新發(fā)現(xiàn)是ASP基因的克隆，它的轉錄產物在正常和凋亡細胞中都有相當水平的表達，編碼具有276個氨基酸的蛋白，其基因與自噬基因APG5同源，提示自噬與凋亡之間存在一定的關系。
5自噬的生理、病理功能
5．1自噬的生理功能
5．1．1自噬在細胞代謝中的作用
自噬能清除不正常構型的蛋白質，并消化受損和多余的細胞器，是真核細胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)。在細胞新陳代謝、結構重建、生長發(fā)育中起著重要作用。在饑餓和新生兒早期，自噬作用明顯加強，自噬體顯著增多。
5．1．2自噬在老化、壽命延長中的作用
隨著年齡的增長，氧化自由基對蛋白質等的損壞以及細胞自噬能力的降低，造成異常蛋白質、DNA以及細胞器進行性地積聚，成為體內的生物垃圾。那些積聚的蛋白質分子是老化與許多急、慢性疾病的主要病因，如老化細胞中的脂褐質、阿爾茨海默病等。胰島素樣信號轉導途徑是線蟲dauer發(fā)育階段和壽命的負調控因子，酪氨酸激酶是該途徑中的一個關鍵蛋白質，與此相關的基因是Cebec-1，而它是ATG6(APG6)/VPS30/Beclin 1的同源基因，這提示自噬與壽命延長相關。
5．2自噬的病理功能
5．2．1自噬與病原微生物侵染
吞噬細胞和淋巴細胞可殺死在細胞外的病原菌，當病原菌以內吞形式進入細胞后自噬是細胞主要的防御形式。如A族鏈球菌內吞小泡進入細胞質后，自噬小泡馬上將其包裹，并運送到溶酶體降解。而在自噬缺陷型細胞中，A族鏈球菌就會存活、繁殖，并從細胞釋放出來再感染其他細胞。
5．2．2自噬與神經退行性疾病
自噬參與異常蛋白質的降解，有利于防止神經元內異常蛋白質的蓄積，如帕金森病中的Synuclein蛋白的蓄積與自噬能力下降有關。因而自噬作用過度活躍會造成線粒體功能障礙，如享延頓氏舞蹈病與享延頓蛋白(Htt)的蓄積，Htt激發(fā)自噬伴隨著細胞凋亡蛋白酶的激活和大量線粒體的受損。
5．2．3自噬與Danon肌病
Danon肌病患者的病理標志是在骨骼肌和心肌細胞胞質中包含有糖原的自噬小泡。實驗發(fā)現(xiàn)小鼠L4MP-2缺失后自噬小泡不能和溶酶體融合，而產生類似Danon肌病的標志性小泡，由此認為原發(fā)Lamp-2缺陷是造成Danon肌病的病因。
5．2．4自噬與腫瘤
人們發(fā)現(xiàn)在癌細胞中自噬能力明顯低于正常細胞，因而對血清/氨基酸降低或高細胞密度等因素反應遲鈍。例如，在轉化的纖維細胞中，其蛋白降解速率低于正常細胞，特別是在饑餓條件下更為明顯。很顯然腫瘤細胞通過改變自噬作用的能力而獲得了比正常細胞更強的生存能力，但其內在機制尚不清楚。不過可以肯定的是Beclin 1的過度表達可以抑制乳腺癌的生長正是通過增強自噬來實現(xiàn)的。
6結語
自噬是廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象，貫穿于正常細胞生長發(fā)育和生理病理過程，對防止如神經退行性病變、腫瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及對防止老化、延長壽命有積極作用。因此對細胞自噬作用和自噬型細胞死亡的研究不僅具有理論意義，而且也具有非常重要的應用價值。自噬基因的發(fā)現(xiàn)使我們從分子水平認識了自噬，但對自噬起源、信號轉導及其對細胞生存影響的了解尚不全面。隨著對自噬作用機制的深入研究，我們期望可以通過調控細胞的自噬水平，控制癌癥及神經退行性疾病的發(fā)展，延緩衰老，提高生存質量。